|
|
| 実験操作の詳細・アガロースゲル電気泳動 (基本セット) |
アガロースゲル電気泳動 (基本セット)
オプションの場合はこちら
DNA断片を電気泳動装置にセットし電気泳動を行う
アガロースゲルの作成方法についてはこちら
DNAサイズマーカー（DNA Ladder）と、次に示す6種類の試料とで合計７種類のサンプルそれぞれに、DNA染色液とローディング・ダイを加え、ゲルのウェルに流し込み、電気泳動装置にセットして、電気泳動像（バンドのパターン）を比較する。
処理済みの６種類のDNAサンプル
(DNA染色液とローディング・ダイを混合済みの場合もある。)
| |
HT |
KT |
XT |
Hc |
Kc |
Xc |
| DNAを抽出した胚 |
ミナミ |
キタ |
両者のF1 |
ミナミ |
キタ |
両者のF1 |
| プライマー |
核遺伝子 TyrF/R |
ミトコンドリア遺伝子 CytbF/R |
| 制限酵素 |
EcoRⅤ |
BglⅡ |
| チューブの色 |
紫 |
薄緑 |
無・黒印 |
桃色 |
水色 |
無・黒印 |
課題 母親はどっち？
電気泳動で得られたバンドパターンから、F1(X)の母親がミナミメダカなのかキタノメダカなのかを判定する。
器具と試薬等
［全体］ 小型遠心機（スピンダウン用）、電気泳動装置、
青色LEDトランスイルミネーター（ 470nm）、オレンジフィルター
［各班］ 2-20μLマイクロピペット、ピペットチップ（チップケース）、
ディスポペトリ皿、0.2mLPCRチューブラック、
★パラフィルム（約3cm幅）
[試薬等］ アガロース（0.4g）、TAEバッファー（ゲル作成用、泳動槽300mL）、
DNAサイズマーカー（100bp DNA Ladder 5μL 透明）、
★DNA染色液（UltraPower DNA Stain希釈液 35μL オレンジ色）、
★ローディング・ダイ（ローディング・バッファー 35μL 濃青緑色）、
★・・・混合済み試料の場合は不要
手順
① チューブラックにチューブを順番に並べる。（マーカー、HT、KT、XT、HC、KC、XC、
★DNA染色液、★ローディング・ダイの順） ★混合済み試料の場合は不要
※混合済み試料の場合は④へ。
②～⑤までのイメージ図を次に示す。
② 3cm程度の幅に切ったパラフィルム上にマイクロピペットでUltraPower DNA Stain
希釈液を4 μL取り7つの液玉を作る。それぞれの液玉の近くにローディング・ダイを
4μL取り液玉を作る。（チップはDNA染色液とローディング・ダイで変える）
③ サイズマーカー、DNAサンプル(HT、KT、XT、HC、KC、XC の順)を4μLずつ
量り取り、UltraPower DNA Stain希釈液とローディング・ダイの液玉を混ぜる。
（ピペッティングする） → 12μLの液玉ができる。
※ピペットの先をパラフィルムに強く押しつけると穴が開いてしまうので注意する
※チップはサンプル毎に変えるが、すぐに使うので触れないように並べおくと良い。
④ 作成したアガロースゲルをゲル枠ごとプラスチック製のペトリ皿に取り出し、
TAEバッファーをウェル（くぼみ）が液に浸かるまで入れる。
⑤ ゲルのウェル（くぼみ）のある方を上にして、ウェルの左から順に、
サイズマーカー、６種のサンプルを 10 μLずつ入れる。
このとき、マイクロピペットを片手で取り扱うのではなく、チップの上のピペットの
部分に他方の手の指を添えて、チップの先がしっかりとウェルの中に入るように
する。
チップの先端が確実にウェルに入っていることを確認してから内容物を出すこと。
また、チップを奥まで入れすぎてゲルを突き抜けることがないように注意する。
このとき、2ndSTOPまで押し込まなくてもよい。
⑥ 電気泳動装置にアガロースゲルをゲル枠ごとセットする。アガロースゲルの
ウェルが電源ユニット側にあることを確認する。
（小型のゲルの場合、同時に２枚セットできる。）
⑦ 電気泳動槽にゲルが十分に浸かるようにTAEバッファーを入れる。（約250mL）
ウェルの部分に気泡が存在する場合は、チップなどを使って気泡を取り除く。
⑧ 電源ユニットを取り付け、泳動槽にフタをする。このフタはベース部分と合うように
一方向だけに装着できるようになっている。
⑨ 泳動方向を確認し（DNAは＋極に向かって移動する）、電圧を100Vにセットし
スイッチを入れる。
⑩ 20分経過したら電気泳動装置のスイッチを切り、コンセントを抜く。
電気泳動像を見る
電気泳動の結果（バンドパターン）を観察する。
① ゲルをトレイから離し、ディスポペトリ皿に移す。
② トランスイルミネーターの電源スイッチをONにして、青色面にペトリ皿をのせ、
オレンジ色のフィルターを通して電気泳動像（バンド）を観察する。
（電気泳動像をデジタルカメラ等で撮影する）
基本操作
マイクロピペットの使い方 ゲルの作製
|
|
msg◎saigot.sakura.ne.jp
メールするときには、お手数ですが◎を＠に変えてお送り下さい。（迷惑メールの排除にご協力下さい。） |
|
Copyright (C) 1997-2022
|
|
