メダカのDNA分析実験キット

実験操作の詳細・ PCR法によるDNAの増幅

PCR法によるDNAの増幅
  
 PCR法によってDNAの特定の部分を増幅する。

器具と試薬等
[試料] 抽出したメダカのDNA(キャップに赤い印0.2mLチューブ、10μL)
[試薬 ]PCRミックス(KOD FX Neo Mix 無印の0.2mLチューブ 16μL)★ 
  プライマー(核遺伝子チロシナーゼ遺伝子領域FとRを混合したもの) 
   蓋に緑の印のある0.2mLチューブに2μL入っている 
   ※プライマーの塩基配列は こちら 
  ★ KOD FX Neo Mix には、
   DNAポリメラーゼ, PCR Buffer (pH 8.5), dNTP(ATCGのヌクレオチド),
   MgCl2、などが入っている。
[器具など] サーマルサイクラー, 微量遠心機, ボルテックスミキサー, 
   マイクロピペット20,ピペットチップ(チップケース),0.2mLPCRチューブラック,
   (クラッシュアイス)

手順
@ 蓋が緑色のPCRチューブ(プライマーが2μL入っている)の記入スペースに
  班番号をマーカーで記入し、スピンダウンする。
  (以降、すべて氷冷下で行うのが望ましい)

A PCRミックスの入っているチューブ(無印のもの)をスピンダウンし、ピペットで
  全量 (16 μL)取って、プライマーの入ったPCRチューブ(緑印)に入れる。
          
B 抽出したミナミメダカDNA(鋳型)を 2 μL 入れる。
   微量なのでチップの先をチューブの内壁面につけて出して、DNAが確実にチューブに入った
   ことを確認するとよい。(水玉ができる)。
          

C チューブの蓋を閉めスピンダウンし、ボルテックスミキサーで攪拌した後、再びスピンダウン
  する。

D 蓋がしっかりと閉まっていることを確認し、軽くボルテックスミキサーで混ぜ、軽く遠心
  (スピンダウン)する。
  (小型遠心機が1.5mlマイクロチューブ用の場合、PCRチューブを遠心する時にはアダプター
  を装着して遠心する。アダプターは1.5mlマイクロチューブの蓋を切り取ったもので代用でき
  る。)

E サーマルサイクラーにセットする。(サンプルブロックに順番にしっかり押し込んで入れ
  る。)
     
F サーマルサイクラーに、次のプログラムをセットし、スタートさせる。終了するのに75分ほど
  かかる。
  途中で、サーマルサイクラーのディスプレイの部分をみると、現在どの段階であるかが分か
  る。

   94℃ 2分 → (98℃ 10秒,64℃ 30秒,68℃ 30秒)25回 → 68℃ 3分 → 4℃ ∞




制限酵素によるDNAの切断  アガロースゲル電気泳動

基本操作
マイクロピペットの使い方  ゲルの作製


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