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PCR法によるDNAの増幅
PCR法によってDNAの特定の部分を増幅する。
器具と試薬等
[試料] 抽出したメダカのDNA(キャップに赤い印0.2mLチューブ、10μL)
[試薬 ]PCRミックス(KOD FX Neo Mix 無印の0.2mLチューブ 16μL)★
プライマー(核遺伝子チロシナーゼ遺伝子領域FとRを混合したもの)
蓋に緑の印のある0.2mLチューブに2μL入っている
※プライマーの塩基配列は こちら
★ KOD FX Neo Mix には、
DNAポリメラーゼ, PCR Buffer (pH 8.5), dNTP(ATCGのヌクレオチド),
MgCl2、などが入っている。
[器具など] サーマルサイクラー, 微量遠心機, ボルテックスミキサー,
マイクロピペット20,ピペットチップ(チップケース),0.2mLPCRチューブラック,
(クラッシュアイス)
手順
@ 蓋が緑色のPCRチューブ(プライマーが2μL入っている)の記入スペースに
班番号をマーカーで記入し、スピンダウンする。
(以降、すべて氷冷下で行うのが望ましい)
A PCRミックスの入っているチューブ(無印のもの)をスピンダウンし、ピペットで
全量 (16 μL)取って、プライマーの入ったPCRチューブ(緑印)に入れる。
B 抽出したミナミメダカDNA(鋳型)を 2 μL 入れる。
微量なのでチップの先をチューブの内壁面につけて出して、DNAが確実にチューブに入った
ことを確認するとよい。(水玉ができる)。
C チューブの蓋を閉めスピンダウンし、ボルテックスミキサーで攪拌した後、再びスピンダウン
する。
D 蓋がしっかりと閉まっていることを確認し、軽くボルテックスミキサーで混ぜ、軽く遠心
(スピンダウン)する。
(小型遠心機が1.5mlマイクロチューブ用の場合、PCRチューブを遠心する時にはアダプター
を装着して遠心する。アダプターは1.5mlマイクロチューブの蓋を切り取ったもので代用でき
る。)
E サーマルサイクラーにセットする。(サンプルブロックに順番にしっかり押し込んで入れ
る。)
F サーマルサイクラーに、次のプログラムをセットし、スタートさせる。終了するのに75分ほど
かかる。
途中で、サーマルサイクラーのディスプレイの部分をみると、現在どの段階であるかが分か
る。
94℃ 2分 → (98℃ 10秒,64℃ 30秒,68℃ 30秒)25回 → 68℃ 3分 → 4℃ ∞
制限酵素によるDNAの切断 アガロースゲル電気泳動
基本操作
マイクロピペットの使い方 ゲルの作製
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