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DNAの抽出
メダカ胚からDNAを抽出する。 (胚はすでにアルコールで固定されている)
器具と試薬等
[試料]ミナミメダカの胚が1個入ったマイクロチューブ(1.5mL),
[試薬]QuickExtract DNA Extraction Solution(QE 0.2mLチューブに入っている)
[器具など]抽出したDNAを入れる0.2mLチューブ(キャップに赤色の印)、ペッスル,ボルテックスミキサー, ウォーターバス65℃,ヒートブロック98℃, フローター, マイクロピペット(20),ピペットチップ(チップケース),微量遠心機,クラッシュアイス(氷とアルミブロック)
手順
@ メダカの固定済みの胚が1個ずつ入った1.5mLマイクロチューブに班番号を書く。
A QuickExtract DNA Extraction Solution を50μL加える。
(抽出溶液の入った0.2mLチューブをスピンダウンして溶液を下に集め、ピペットで全量を移す)
B ペッスルで胚を十分につぶす。
※実体顕微鏡でつぶされていることを確認すると良い。
※胚はペッスルでチューブの側面に押しつけてつぶすと良い。先端部ではつぶしにくい。
C 蓋をしてボルテックスミキサーで15秒間内容物を十分攪拌する。(蓋がしっかり閉まっていることを確認して、チューブの上部をしっかりと持ち、チューブの下部をミキサーの振動部分に押しつける。
D 小型遠心機にかけて、内容物をチューブの下部に集める。(「スピンダウン」と言う)
E チューブをフローターにさして65℃のウォーターバスに浮かべ、10分間保温する。
F ボルテックスミキサーで15秒間攪拌して内容物をよく混ぜる。(方法はC参照) 攪拌後はスピンダウンする。
G チューブをブロックヒーターのアルミブロックに入れ、98℃で2分間保温する。
H ボルテックスミキサーで15秒間攪拌して内容物をよく混ぜる。攪拌後はスピンダウンする。
I 98℃のブロックヒーターでさらに2分間保温する。
J 氷上で温度を下げる。
(クラッシュアイスの中に奥まで入れるか、氷上においたアルミブロックに入れる)
K 15,000回転で2分間遠心する。
※遠心機にセットするときに、チューブの蓋と本体の接続部分の突起を外側に揃えておくと、沈殿ができる位置が推定できるので、次の作業がしやすくなる。
L 上清(DNAが溶けている部分)をマイクロピペット(10μLにセット)で10μL量り取り、0.2mLチューブ(蓋が赤色の印)に入れる。この液を鋳型DNA(ミナミメダカ)として次のPCR法Bで使用する。(遠心の結果、チューブの下部の側面に沈殿ができる。上清を取る時にチップの先端がこの部分に触れないように注意すること。沈殿に触れてしまったら、再度遠心する。)
PCR法によるDNAの増幅 制限酵素によるDNAの切断 アガロースゲル電気泳動
基本操作
マイクロピペットの使い方 ゲルの作製
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